Johann Deisenhofer là con đầu lòng của Johann Deisenhofer và bà Thekla. Năm 1949, ông học trường tiểu học ở Zusamaltheim tới năm 1956. Sau đó ông học trường "Knabenmittelschule HI. Kreuz", Donanwoerth, từ năm 1957 tới 1959 học trường "Staatliche Realschule Wertingen", từ năm 1959 tới 1963 học trường trung học "Holbein Gymnasium", Augsburg và tốt nghiệp trung học năm 1963.

Sau khi thi hành nghĩa vụ quân sự 18 tháng, cuối năm 1965 ông vào học ngành vật lý ở Đại học Kỹ thuật München và đậu bằng cử nhân vật lý. Tuy nhiên sau đó, ông lại chuyển sang nghiên cứu hóa học ở Viện Hóa sinh Max Planck tại Martinsried, Tây Đức từ tháng 6 năm 1971, và đậu bằng tiến sĩ vào cuối năm 1974.